無(wú)菌操作技術(shù)不僅在微生物學(xué)研究和應(yīng)用上起著舉足輕重的作用，在許多生物技術(shù)中也被廣泛應(yīng)用，例如轉(zhuǎn)基因技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)等。

 

無(wú)菌室，微生物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)專辟的一個(gè)小房間，室外設(shè)一個(gè)緩沖間，緩沖間的門和無(wú)菌室的門不要朝向同一方向，以免氣流帶進(jìn)雜菌。無(wú)菌室和緩沖間都必須密閉，無(wú)菌室內(nèi)的地面、墻壁必須平整，不易藏污納垢、便于清洗，室內(nèi)裝備的換氣設(shè)備必須有空氣過(guò)濾裝置。工作臺(tái)的臺(tái)面應(yīng)該處于水平狀態(tài)，無(wú)菌室和緩沖間都裝有紫外線燈（距離工作臺(tái)面1米），工作人員進(jìn)入無(wú)菌室應(yīng)穿戴滅過(guò)菌的服裝、帽子。

 

超凈臺(tái)，主要功能是利用空氣層流裝置排除工作臺(tái)面上部包括微生物在內(nèi)的各種微小塵埃，通過(guò)電動(dòng)裝置使空氣通過(guò)高效過(guò)濾器具后進(jìn)入工作臺(tái)面，使臺(tái)面始終保持在流動(dòng)無(wú)菌空氣控制之下。在條件較困難的地方，也可以用木制無(wú)菌箱代替超凈臺(tái)（正面開有兩個(gè)洞，不操作時(shí)用推拉式小門擋住，操作時(shí)可以將雙臂伸進(jìn)去；正面上部裝有玻璃，便于在內(nèi)部操作，箱內(nèi)部裝有紫外線燈，從側(cè)面小門可以放進(jìn)去器具和菌種、細(xì)胞株等）。

 

微生物的培養(yǎng)

 

在微生物的培養(yǎng)過(guò)程中，要保持培養(yǎng)物純凈性；培養(yǎng)微生物的要*，是為所需要的微生物提供良好的生存環(huán)境，同時(shí)阻止或抑制其他微生物的生長(zhǎng)。

 

（一）培養(yǎng)基

1.認(rèn)識(shí)培養(yǎng)基的基本組成成分，從生物體構(gòu)成的基本元素這一角度理解培養(yǎng)基中為什么都需要具備這些基本成分。

2.培養(yǎng)基的用途和種類：液體和固體兩大類。

3.不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方；盡管培養(yǎng)基的配方各不相同，但是其基本成分都包括水、碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽。

4.培養(yǎng)基是否合格（無(wú)菌試驗(yàn)）：培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無(wú)菌落生長(zhǎng)（液體不變渾濁），說(shuō)明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。

 

（二）無(wú)菌技術(shù)

 

1.  無(wú)菌技術(shù)的概念
無(wú)菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。日常的生活環(huán)境中，每時(shí)每刻每處都存在著微生物，任何一個(gè)不經(jīng)意的動(dòng)作都可能將某種微生物引入到培養(yǎng)物中。在具備無(wú)菌環(huán)境和獲得無(wú)菌材料后，還要始終保持無(wú)菌狀態(tài)，才能對(duì)某種特定的已知微生物進(jìn)行研究或利用它們的功能，否則外界的各種微生物很容易混入。外界不相干的微生物混入的現(xiàn)象，在微生物學(xué)叫做污染雜菌。防止污染是微生物學(xué)工作中十分關(guān)鍵的技術(shù)：徹底滅菌和防止污染是無(wú)菌技術(shù)的兩個(gè)方面。此外，要有效避免操作者自身被微生物感染，還要防止所研究的微生物，特別是致病微生物或經(jīng)過(guò)基因工程改造了的本來(lái)自然界不存在的微生物從我們的實(shí)驗(yàn)容器中逃逸到外界環(huán)境中去（生物安全）。無(wú)菌操作非常重要，無(wú)論是倒平板、平板劃線操作，還是平板稀釋涂布法，其操作中的每一步都需要做到“無(wú)菌”，只有熟練、規(guī)范地進(jìn)行無(wú)菌操作，才可能成功地培養(yǎng)微生物。

 

2.  消毒與滅菌的概念

（1）培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（需要滅菌）

（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（需要滅菌）

（3）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手（需要消毒）

（4）接種環(huán)、針、涂布棒：灼燒滅菌（外焰）。

 

3.倒平板

（1）滅菌后，培養(yǎng)基冷卻到55 ℃后應(yīng)及時(shí)進(jìn)行倒平板操作，如果不能及時(shí)操作，需要將培養(yǎng)基放到55℃左右的電熱箱中保溫，以防止瓊脂凝固（用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺(jué)錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了）；每個(gè)72mm培養(yǎng)皿需要培養(yǎng)基12~15ml。

（2）為什么要使錐形瓶的瓶口通過(guò)火焰？

答：通過(guò)灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。

（3）平板冷凝后，為什么要將平板倒置？

答：平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。

（4）在倒平板的過(guò)程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來(lái)培養(yǎng)微生物嗎？為什么？

答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此**好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。

 

4.  平板劃線

（1）為什么在操作的**步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

答：操作的**步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來(lái)源于上次劃線的末端，從而通過(guò)劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到單個(gè)菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的細(xì)菌，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。

（2）在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？

答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死細(xì)菌。

（3）在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？

答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，**終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)的菌落。

 

5.  涂布平板
應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“無(wú)菌”，涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍，等等。

 

細(xì)胞培養(yǎng)

體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定細(xì)胞培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵。即便使用設(shè)備完善的實(shí)驗(yàn)室，若實(shí)驗(yàn)者粗心大意，操作技術(shù)不規(guī)范，也會(huì)導(dǎo)致污染。因而，所有操作都要**大可能的保證無(wú)菌，每一項(xiàng)工作都必須做到有條不紊和完全可靠。（心中有數(shù)）

 

（一）培養(yǎng)前準(zhǔn)備
在開始實(shí)驗(yàn)前要制定好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點(diǎn)無(wú)誤后將其放置操作場(chǎng)所(培養(yǎng)室、超凈臺(tái))內(nèi)，然后開始消毒。這樣可以避免開始實(shí)驗(yàn)后，因器材不全往返拿取而增加污染機(jī)會(huì)。

 

（二）操作區(qū)消毒
無(wú)菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面一次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺(tái)臺(tái)面每次實(shí)驗(yàn)前要用70酒精擦洗，然后紫外線消毒30min。在工作臺(tái)面消毒時(shí)切勿將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同時(shí)照射紫外線，消毒時(shí)工作臺(tái)面上用品不要過(guò)多或重疊放置，否則會(huì)遮擋射線降低消毒效果。實(shí)驗(yàn)用品，如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用要用70%酒精擦拭后才能帶入無(wú)菌操作臺(tái)，同時(shí)紫外線消毒。

 

（三）洗手和著裝
原則上和外科手術(shù)相同。平時(shí)僅做觀察不做培養(yǎng)操作時(shí)，可穿裝細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)紫外線照射30min的清潔工作服。在利用超凈臺(tái)工作時(shí)，因整個(gè)前臂要伸入箱內(nèi)，應(yīng)著長(zhǎng)袖的清潔工作服，并于開始操作前要用70%酒精消毒手。如果實(shí)驗(yàn)過(guò)程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。

 

（四）火焰消毒
在無(wú)菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無(wú)菌工作時(shí)，shou先要點(diǎn)燃酒精燈。以后一切操作，如安裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處進(jìn)行。但要注意：燒過(guò)的金屬鑷要待冷卻后才能挾取組織，以免造成組織損傷；吸取過(guò)營(yíng)養(yǎng)液后的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管頭中營(yíng)養(yǎng)液能燒焦形成炭膜，再用時(shí)會(huì)把有害物帶入營(yíng)養(yǎng)液中；開啟、關(guān)閉長(zhǎng)有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶時(shí)，火焰滅菌時(shí)間要短，防止因溫度過(guò)高燒死細(xì)胞；另外膠塞過(guò)火焰時(shí)也不能時(shí)間長(zhǎng)，以免燒焦產(chǎn)生有毒氣體，危害培養(yǎng)細(xì)胞。

 

（五）操作
開啟無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘后，才可開始實(shí)驗(yàn)操作，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，幅度不能太大，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。無(wú)菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔與寬敞，必要物品，如試管架，移液器或吸管頭等可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完后應(yīng)及時(shí)移出,以利氣體流通。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在操作臺(tái)中央無(wú)菌區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，勿在邊緣非無(wú)菌區(qū)域操作。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。為拿取方便，工作臺(tái)面上的用品要有合理的布局，原則上應(yīng)是右手使用的東西放在右側(cè)，左手用品在左側(cè)，酒精燈置于中央。工作自始**終要保持一定順序性，組織或細(xì)胞在未做處理之前，勿過(guò)早暴露在空氣中。同樣，培養(yǎng)液在未用前，不要過(guò)早開瓶；用過(guò)之后如不再重復(fù)使用，應(yīng)立即封閉瓶口（敞開直立可增加落菌污染機(jī)會(huì)）。吸取營(yíng)養(yǎng)液、PBS、細(xì)胞懸液及其它各種用液時(shí)，均應(yīng)分別使用吸管，不能混用，以防擴(kuò)大污染或?qū)е录?xì)胞交叉污染。工作中不能面向操作區(qū)講話或咳嗽，以免唾沫把細(xì)菌或支原體帶入工作臺(tái)面發(fā)生污染。手或相對(duì)較臟的物品不能經(jīng)過(guò)開放的瓶口上方，不要在打開的容器正上方操作實(shí)驗(yàn)容器打開后，用手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放在臺(tái)面上。瓶口**易污染，加液時(shí)如吸管、吸頭尖碰到瓶口、瓶外，則應(yīng)將吸管換掉。每次操作只處理一株細(xì)胞，以免造成細(xì)胞交叉污染。驗(yàn)結(jié)束后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，如需要繼續(xù)進(jìn)行下一個(gè)實(shí)驗(yàn)，則用70% 酒精擦拭無(wú)菌操作臺(tái)面，再讓無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘后，才可進(jìn)行下一個(gè)實(shí)驗(yàn)操作。

 

（六）安全
工作人員應(yīng)注意自身的安全，必須穿戴實(shí)驗(yàn)衣與手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于來(lái)自人源性或病毒感染的細(xì)胞株應(yīng)特別小心,并選擇適當(dāng)?shù)燃?jí)的無(wú)菌操作臺(tái)(**少兩級(jí))。操作過(guò)程中，應(yīng)避免氣溶膠的產(chǎn)生，小心有毒性試劑，例如DMSO（二甲基亞砜），并避免尖銳物品傷人等。

 

（七）定期檢測(cè)下列項(xiàng)目

 

1. CO2 鋼瓶的CO2 壓力

 

2.  CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無(wú)菌水，每周更換)； CO2 培養(yǎng)箱定期消毒。

 

3.   無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)氣流壓力是否正常，定期更換紫外線燈管及HEPA 過(guò)濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300 小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時(shí)/HEPA)。